high-performance size exclusion chromatograghy

高效分子量排阻层析（HPSEC）又称高效凝胶过滤层析，它根据分子量大小来分离分子。凝胶基质由特定大小孔隙的球形小珠组成，不同分子量的分子从孔中排阻通过，发生分离。小分子进入孔内，会延滞它们通过层析柱，而大分子避开孔，洗脱入层析柱外水体积。因此，样品根据分子量大小进行分离，并依照分子量递减顺序洗脱。

依据层析目的和所需的分辨率来选择操作条件和介质。分子量排阻层析中一种常规的方法为基团分离，包括：

脱盐— 目标分子洗脱出来，而小分子保留在凝胶孔内。为了获得理想的分离，基质的分子量排阻限度应比目 标分子小。

分级分离— 一定分子量范围的分子在凝胶基质内分离。使用这种方法时，目标分子应当在凝胶的分级分离范 围以内。

高效分子量排阻层析常规应用包括蛋白分级分离及分子量确定、核酸分离、质粒纯化和多糖分级分离。

层析分辨率取决于颗粒大小、孔径大小、流速、层析柱尺寸和样品体积。通常，低流速（2–10 cm/hr）、细长 柱、小颗粒凝胶、小样品体积（总床体积的1–5%）、2 倍的分子量差异以及相同的溶液粘度，可以获得最高分辨率。 如果用于脱盐，样品体积则可达到总床体积的30–40%，并可使用短粗柱。

与分子筛层析(gel filtration chromatography)相比，HPSEC在分辨率以及分离时间上都具有明显的优势。

GFP 是什么？EGFP与GFP有什么区别？

GFP 绿荧光蛋白(Green Fluorescent Portein，GFP)

绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，发射绿色荧光。其独特之处在于：它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的来源于水母的氨基酸残基组成。水母的绿色荧光蛋白很稳定，无种属限制，已在多种动植物细胞中表达成功并产生荧光。 GFP ?的荧光受外界的影响较小，另外GFP 的检测十分方便，而对细胞的伤害极小。( LUYOR-3260RB 便携式GFP 激发光源 可轻松激发GFP荧光，迅速定位GFP表达位置），由于这些优点，GFP 已经成为检测体内基因表达及细胞内蛋白质原位定位的极为重要的报告分子。

2. 绿色荧光蛋白的表 达和成熟

GFP ?的表达水平受多种因素的影响。在植物细胞中表达GFP 时，改变一些原GFP 基因的密码子为该植物使用的偏爱密码子，并消除潜在的剪接位点。目前适用于哺乳动物的表达系统不受影响。GFP 还可以顺利的在无细胞的体外翻译系统中表达并自发折叠。用一些小体积的氨基酸残基取代大体积残基可以提高GFP 在高温下正确折叠的速度。这些突变位点分布于成熟蛋白质三维结构的各个部位，几乎不能提供如何帮助GFP 折叠和成熟的线索。另外，分子伴侣的存在也有助于GFP 的折叠，反过来，这个发现也使GFP 成为检测分子伴侣功能的一个好底物，因为GFP 可以提供一个连续的、无破坏性的检测蛋白折叠成功的分析方法。

3. 绿色荧光蛋白的应用

3.1报告基因和细胞标记

GFP 作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与；无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率。但在这方面的应用中，最大的缺点就是没有放大作用，它不能象酶一样能通过加工无数的底物分子而将信号放大所以一般都需强启动子以驱动GFP 基因在细胞内足量的表达也可用亚细胞分辨率的显微成像系统检测基因产物，靶入的基因被限制于一个细胞器内，GFP 的浓度则相对提高了许多倍。

3.2融合标记

应用得最多和最成功的是GFP 同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位和最后归宿既有荧光又有宿主蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳GFP 可融合于宿主蛋白的C 端或N 端，也可插入其内部迄今为止，GFP 已成功地靶入了大部分细胞器中，如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。

3.3 其它

GFP 分子生色团的坚固外层保护荧光不被熄灭，但同时也降低了GFP 分子的荧光对环境的敏感性通过随机重组和基因定向突变得到了多种对环境敏感的GFP ，它们可用作环境指示剂如：对PH 敏感GFP 的可以测定细胞器内的PH 值；通过基因工程，可GFP 在中插入磷酸化位点以便用磷酸化控制GFP 的荧光。另外，最近报道的利用靶入了水母GFP 基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的基因取代了蚕的正常基因，当蚕吐丝时这种丝是一种能在黑暗中发绿色荧光的纤维。

4. GFP应用特点

GFP 这一新型报告基因，在短短几年时间内就得到了众多研究者的青睐，其原因就在于它具有以下优点：

(1)检测方便：因为GFP 荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质可能难进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。

(2)荧光稳定：GFP 对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；对高温 (70℃) 、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。

(3)无毒害：从目前的研究结果来看，GFP 对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代。

(4)共用性和通用性：首先表现在GFP 的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达其次是GFP 没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。

5) 易于构建载体：由于GFP 分子量较小，编码GFP 的基因序列也很短，为所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。

(6)可进行活细胞定时定位观察：对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。通过GFP 可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的。

5. 展望

尽管GDP 基因作为新型报告基因越累越受到关注，但必尽只是近几年的事，对GDP 的基础理论研究远远赶不上其应用的速度。目前还存在很多的问题，如除了水母外的其他发光生物（如珊瑚、水螅等）中基因的克隆、是怎样折叠成桶状结构的、突变是如何影响生色团形成的、荧光波长是否可以再增加以适合更多种标记和报告分子及中介转移受体、可否在的分子内部融合其他蛋白质以及研究如何利用生物合成有色纤维、多数生物有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，影响某些GDP 的检测，新生GDP 通过折叠和加工成为具有活性的性质，过程十分缓慢紫外激发对某些GDP 有光漂白和光破坏作用，导致荧光型号快速丧失等。随着对GDP 的基础理论研究的发展和新型突变体的不断出现，我们有理由相信这些问题最终会得到解决，它的开发及应用将会带来更加广阔的前景。

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EGFP是GFP突变系

(1)RedShifted(红偏移)GFP突变系(EGFP & GFPS65T)

色基发生了氨基酸取代，λmax(Excitation)偏移至490nm附近。红偏移突变系的最大激发峰都落在常用滤色片的波长范围内，所以获得的荧光信号要比wtGFP明亮得多。同样，FACS和共焦显微镜的氩离子光源的发射波长为488nm，对RedShifted突变系的激发效率也明显高于wtGFP。 EGFP 发生了双氨基酸取代，Leu(亮氨酸)取代Phe64(苯丙氨酸)，Thr(苏氨酸)取代Ser65(丝氨酸)(Cormack et al.,1996)。基于等量溶解蛋白的光谱分析，由于Em(消光系数)的增加和色基构型的高效率，EGFP在488nm处激发后灯荧光强度为wtGFP的35倍(Cormack et al.,1996;Yang et al.,1996)。在相同条件下(489nm)测得EGFP得Em为53，000cm-1M-1，而wtGFP为9，500CM-1M-1，GFPS65T为55，000cm-1M-1(Patterson et al.,1997)。EGFP的色基构型在37℃比wtGFP或GFPS65T发光效率更高，在这一温度下表达的EGFP可溶性蛋白95%为有效色基(Patterson et al.,1997)。GFPS65T为Thr取代Ser65的突变体(Heim et al.,1995)，同样条件下，它的荧光强度强于wtGFP4～6倍，并且其唯一的Redshifted激发峰位于490nm，但37℃时色基形成的效率不如EGFP。

Introduction to GFP

Green Fluorescent Protein (GFP) is a 26.9 kDa protein first identified in crystal jellyfish, Aequorea victoria. It was discovered that when exposed to blue or ultraviolet light the protein fluoresces green. After GFP was first expressed in E. coli in 1994 it was soon confirmed that GFP can also be successfully expressed in other organisms as well. Since then, not only have many fluorescent proteins of different colors been generated, but their function is enhanced to provide a faster and stronger fluorescent signal.

GFP Applications

?GFP is often used as a reporter of gene or protein expression. By detecting GFP expression it is possible to quantify the transfection/transduction efficiency.?

?By staining the cells with propidium iodide we can monitor the viability of the culture during GFP expression.?

?In cultures that are co-transduced with GFP and RFP, the Cellometer has the capability to capture, analyze, and report the population of GFP positive, RFP positive, or dual positive.

eGFP : enhanced Green Fluorescent Protein 增强绿色荧光蛋白, EGFP是GFP突变系

目前应用 较多的是 GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋 白( E G F P )( 6 4位苯丙一亮) ， 发射出的荧光强度 比GFP大 6 倍以上， 因此， 比GFP更适合作为 一种报告基 因来研究基因表达、 调控、 细胞分化及蛋 白质 在生物体内定位和转运等。绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表,生存历史超过1.6亿年。1962年,下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

荧光蛋白定位激发光源LUYOR-3260放置在物镜前方的阻挡滤光片可根据要求规格订做。此激发光源与护目镜LUV-495共同使用，可在动物设备的固定位置如消毒层流柜直接观察绿色荧光蛋白（GFP）。两个握杆之间的空间可容纳小动物的笼子（如小鼠）。荧光蛋白定位激发光源可与荧光蛋白观察镜LUV-495或 LUV-590起使用直接观察绿色荧光蛋白（GFP）或**荧光蛋白（YFP）。

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