新鲜细胞和冻存的细胞提取蛋白有区别么

一、材料

（一）仪器

1.

净化工作台

2.

离心机

3.

恒温水浴箱

4.

冰箱（4℃、-20℃、-70℃）

5.

倒置相差显微镜

6.

培养箱

7.

液氮冰箱

（二）玻璃器皿

1.

吸管（弯头、直头）

2.

培养瓶

3.

玻璃瓶（250ml、100ml）

4.

废液缸

（三）塑料器皿

1.

吸头

2.

枪头

3.

胶塞

4.

移液管（10ml）

5.

15ml离心管

6.

冻存管（1～2ml）

（四）其他物品

1.

微量加样枪

2.

红血球计数板

3.

记号笔

4.

医用橡皮膏

5.

移液枪

（五）试剂

1.

d-hanks液

2.

小牛血清

3.

培养液

4.

双抗（青霉素、链霉素）

5.

胰蛋白酶（0.08%）

6.

1nhcl

7.

7.4%nahco3

8.

dmso（分析纯）或无色新鲜甘油

二、操作步骤

（一）细胞冻存

1.

配制含10%dmso或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2.

取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；

3.

离心1000rpm，5min；

4.

去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

5.

将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5

ml；

6.

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

7.

冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/

min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/

min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h

，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二）

细胞复苏

1.

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.

从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3.

离心，

1000rpm，5min；

4.

弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5.

次日更换一次培养液，继续培养。

三、注意事项

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

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