如何通过育种及分子改造等得到高产此发酵产品的优良菌种

1．菌体的选育：

自然选育 在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自发突变,从而选育出优良菌种的过程,叫做自然选育.菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退,生产性能下降；另一种是代谢更加旺盛,生产性能提高.具有实践经验和善于观察的工作人员,就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化,选育出优良菌种.例如,在谷氨酸发酵过程中,人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种.又如,在抗生素发酵生产中,从某一批次高产的发酵液取样进行分离,往往能够得到较稳定的高产菌株.但自发突变的频率较低,出现优良性状的可能较小,需坚持相当长的时间才能收到效果.

诱变育种 诱变育种是指用人工的方法处理微生物,使它们发生突变,再从中筛选出符合要求的突变菌株,供生产和科学实验用.诱变育种与其他育种方法相比,具有操作简便、速度快和收效大的优点,至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法.诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分.

菌种经诱变处理后,会产生各种各样的突变类型.如何从中挑选出所需要的突变类型呢?一般要经过初筛和复筛两个阶段.下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例说明.将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后,涂布在平板培养基上.培养后,将单个菌落挑到斜面培养基上,经培养后,再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中,振荡培养后测它们的抗生素效价.这就是初筛.初筛中所得到的超过对照效价10%以上的菌种,再进行复筛.复筛的过程与初筛基本相同,不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中,得出平均效价.复筛可进行1～3次.由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验,才能用到发酵生产中.

2．培养基的配置：

（1）原料：碳源,氮源,生长因子,无机盐和水.

（2）原则：目的要明确,营养要协调,PH要适宜.

3．灭菌：

发酵过程中不能有杂菌污染,不仅要对培养基进行灭菌,还要对发酵装置进行灭菌,通入的空气也要进行灭菌.灭菌不仅要杀死杂菌细胞,还要杀死芽孢和孢子.

4．扩大培养和接种：扩大培养可以缩短微生物生长的调整期.

5．发酵过程：是发酵的中心阶段.

关键是控制发酵的条件,如温度,pH,溶氧,通气量与转速等.原因是环境条件的变化,不仅会影响菌种的生长繁殖,还会影响菌种代谢产物的形成.

影响发酵过程的因素 影响发酵过程的因素主要有以下几个方面.

温度 温度对微生物的影响是多方面的.首先,温度影响酶的活性.在最适温度范围内,随着温度的升高,菌体生长和代谢加快,发酵反应的速率加快.当超过最适温度范围以后,随着温度的升高,酶很快失活,菌体衰老,发酵周期缩短,产量降低.温度也能影响生物合成的途径.例如,金色链霉菌在30 ℃以下时,合成金霉素的能力较强,但当温度超过35 ℃时,则只合成四环素而不合成金霉素.此外,温度还会影响发酵液的物理性质,以及菌种对营养物质的分解吸收等.因此,要保证正常的发酵过程,就需维持最适温度.但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同.如灰色链霉菌的最适生长温度是37 ℃,但产生抗生素的最适温度是28 ℃.通常,必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度,采取分段控制.

pH pH能够影响酶的活性,以及细胞膜的带电荷状况.细胞膜的带电荷状况如果发生变化,膜的透性也会改变,从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌.此外,pH还会影响培养基中营养物质的分解等.因此,应控制发酵液的pH.但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH往往不同,需要分别加以控制.在发酵过程中,随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累,发酵液的pH必然会发生变化.如当尿素被分解时,发酵液中的NH+4浓度就会上升,pH也随之上升.在工业生产上,常采用在发酵液中添加维持pH的缓冲系统,或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸钙来控制pH.目前,国内已研制出检测发酵过程的pH电极,用于连续测定和记录pH变化,并由pH控制器调节酸、碱的加入量.

溶解氧 氧的供应对需氧发酵来说,是一个关键因素.从葡萄糖氧化的需氧量来看,1 mol的葡萄糖彻底氧化分解,需6 mol的氧；当糖用于合成代谢产物时,1 mol葡萄糖约需1.9 mol的氧.因此,好氧型微生物对氧的需要量是很大的,但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧,然而氧很难溶于水.在101.32 kPa、25 ℃时,氧在水中的溶解度为0.26 mmol/L.在同样条件下,氧在发酵液中的溶解度仅为0.20 mmol/L,而且随着温度的升高,溶解度还会下降.因此,必须向发酵液中连续补充大量的氧,并要不断地进行搅拌,这样可以提高氧在发酵液中的溶解度.

食用菌良种选育及繁殖的工艺流程是怎样的？

发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配置、灭菌、种子扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。

优良菌株的选育的目的是防止菌种退、解决生产实际问题、提高产品质量和开发新产品。选育的方法主要有基于基因突变的自然选育和诱变育种以及基于基因重组的杂交、原生质体融合、基因工程等。．菌体的选育：

自然选育 在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自发突变,从而选育出优良菌种的过程,叫做自然选育.菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退,生产性能下降；另一种是代谢更加旺盛,生产性能提高.具有实践经验和善于观察的工作人员,就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化,选育出优良菌种.例如,在谷氨酸发酵过程中,人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种.又如,在抗生素发酵生产中,从某一批次高产的发酵液取样进行分离,往往能够得到较稳定的高产菌株.但自发突变的频率较低,出现优良性状的可能较小,需坚持相当长的时间才能收到效果.

诱变育种 诱变育种是指用人工的方法处理微生物,使它们发生突变,再从中筛选出符合要求的突变菌株,供生产和科学实验用.诱变育种与其他育种方法相比,具有操作简便、速度快和收效大的优点,至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法.诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分.

食用菌菌种制备程序包括菌种的选育和菌种的繁殖培养两个阶段。食用菌菌种选育工作的目的是通过各种手段，一方面要打破遗传的保守性，促成性状的变异；同时又要通过选择，把有益的变异传递给下一代，这样才能不断选育出高产优质、抗逆性强的菌株（图2-4）。

图2-4 食用菌良种选育流程图

（王世东，2000）

食用菌的固体菌种生产与液体菌种生产的设备选型和场所要求是大不相同的。固体菌种生产也因各级菌种生产所使用基质不同而操作过程的条件和步骤也有所差异，但作为一种生产工艺流程来说是大致相同的（图2-5）。

图2-5 食用菌良种繁育工艺流程图

（王世东，2000）

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