分子杂交技术具体包含了哪些物质的杂交技术?这些技术之间有什么不同?

分子杂交（molecularhybridization）确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。

探针：标记方法有多种，常用的为同位素标记法和生物素标记法。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。

杂交技术：目前使用较多的是固相杂交法。此法是先将待测单链核酸样品（如为双链，则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。通过与电泳法和放射自显影法结合，获得杂交图谱，再进行定性或定量分析。分子杂交方法广泛用于生物化学、分子生物学中作为核酸片段碱基序列的检测与鉴定手段。在医学领域中已用于某些病毒或细菌引起的感染性疾病的诊断。它也可用于基因工程。不同来源蛋白质的亚基结合过程也可称为杂交。

在液相分子杂交中，两种来源的核酸分子都处于溶液中，可以自由运动，其中有一种常是用同位素标记的。从复性动力学数据的分析可探知真核生物基因组结构的大致情况，如各类重复顺序的含量及分布情况等。在固相分子杂交中，一种核酸分子被固定在不溶性的介质上，另一种核酸分子则处在溶液中，两种介质中的核酸分子可以自由接触。常用的介质有硝酸纤维素滤膜、羟基磷灰石柱、琼脂和聚丙烯酰胺凝胶等。早期用琼脂作为固定介质的分子杂交方法曾被用来测定从细菌到人多种生物的DNA的同源程度。

（1）固相杂交

将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以最为常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

（2）液相杂交

所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，一种研究最早且操作复合的杂交类型，在过去的30年里虽有时被应用，但总不如固相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展。

编辑本段固相膜核酸分子杂交（1）菌落原位杂交

（Colonyinsituhybridization）　　

将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA，再烘干固定DNA于膜上，与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

（2）斑点杂交

（Dotblotting）

该方法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。

（3）Southern印迹杂交

（Southernblotting）

是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜（尼龙膜也较长用）上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（4）Northern印迹杂交

（Northernblotting）　　

DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为westernblotting。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因它为影响RNA与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加标记物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、照像。样品胶则进行Northern转印，标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min，在水中就可脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

（5）组织原位杂交

（Tissueinsituhybridization）　　

简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置；对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。

用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针，探针的长度通常以100～400nt为宜，过长则杂交效率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16～30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针。因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交的优选探针。

回交是子一代和两个亲本的任意一个进行杂交的方法叫作回交。回交和杂交的主要区别在于：回交是子一代与两个亲本中的任意一亲本进行杂交；杂交生物学上指不同种 、属或品种的动、植物进行交配。

当然杂交和回交的结果也不相同。

在遗传学研究中，常利用回交的方法来加强杂种个体 的性状表现，特别是与隐性亲本的回交，它是检验子一代的基因型的重要方法。用回交方法所产生的后代称为回交杂种。

育种工作中，常利用回交的方法来加强杂种个体中某一亲本的性状表现。用回交方法所产生的后代称为回交杂种。被用来回交的亲本称为轮回亲本，未被用来回交的亲本称为非轮回亲本。

杂交产生的后代称为杂种。不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为远缘杂交，所得个体称为远缘杂种。相反地，亲缘关系极近的个体间杂交称为近亲交配，或称近交，包括兄妹杂交、半兄妹杂交等等（见近亲结婚）。

近交可以用来建立纯系。同一个体或同一无性繁殖系的个体间交配称为自交。除自交之外的一切交配，不论亲体双方的基因型有无差异都属于异交。

杂交之谜

科学家早已知道，诸如杂交玉米等杂交植物比它们的亲本更为健壮，产量更高，种子更大。在多倍体植物中也具有类似的现象，超过70%的开花植物都是天然的多倍体。

然而，科学家一直未能理解其中的分子机制。中美科学家研究发现，杂交植物比其亲本生长更大更好的原因在于，它们负责光合作用和淀粉代谢的基因在白天更为活跃。这一发现在提高燃料作物和粮食作物产量方面将产生巨大影响。

在最新的研究中，美国德州大学和中国农业大学的研究人员利用拟南芥研究发现，在杂交植物和多倍体植物中，与光合作用和淀粉代谢有关基因的表达得到了增加，在白天的时候，表达量是其亲本的好几倍。

杂交植物和多倍体植物表现出更多的光合作用、叶绿素和淀粉积聚，所有这些导致植株更加高大。

在进一步的研究中，研究人员在杂交植物和多倍体植物中发现了生理时钟调节子和生长势之间的直接联系。生理时钟控制着植物和动物的生长和代谢。

研究人员发现，在白天的时候，杂交植物和多倍体植物中的一些调节子——转录抑制子被更多地抑制，导致光合作用和淀粉积聚增加。

研究人员表示，利用这一发现，可以开发基因组和生物技术工具，以发现和培育更好的杂交和多倍体植物。

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