抗体检测怎么检测（核酸、抗原、抗体检测）

自 2020 年新冠疫情爆发以来，「核酸检测」作为一项检测是否感染的重要指标，开始反复出现在我们的生活中。2022 年 3 月 10 日，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组发布通知，决定推进「抗原筛查、核酸诊断」的检测模式，在核酸检测基础上增加抗原检测作为补充。

抗原检测是什么？和其他的检测手段有什么不同？这篇文章，我们以新型冠状病毒为例，讲讲常见的快速筛查手段，聊聊相关的原理以及适用范围。

当我们做筛查时，能查的究竟有什么

想要对一种疾病或是一种物质进行筛查，我们首先要弄清楚的就是「从何下手」的问题，其次是「如何检测」，让微观世界的变化反映到我们眼前，帮助我们作出判断。

从何下手

我们面对的是病毒。根据大家耳熟能详的中学生物课知识，病毒是一类由遗传物质和蛋白质外壳组成的类生命体 。如果想对病毒的感染情况进行探测，就需要从它的组分下手。接下来的内容，希望大家带着自己中学的生物知识阅读。

以目前正在困扰我们的 SARS-CoV-2 为例。它属于冠状病毒科下，冠状病毒亚科的乙型冠状病毒属，是已知的第七种能够感染人类的冠状病毒。所有的冠状病毒都是具有 包膜 的 正义单链 RNA 病毒 ，也就是说，它们的遗传物质是一条单独的 RNA 链，并且这条 RNA 链可以直接作为 mRNA（信使 RNA）参与翻译，指导蛋白质的合成。

编号为NPRC 2020.00002的毒种，由国家病原微生物资源库（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所）提供。

我们现在的目的是检测标本中是否存在这种病毒，无论是检测它本身，还是检测病毒带来的产物，能够下手的方向也就是两种：蛋白质外壳（包膜）、遗传物质。

如何检测

顺着这个逻辑，那最显而易见的方法就是检查它「能不能看到」，但病毒本体小得很，SARS-CoV-2 的直径在 80-120 nm，要想每个标本都拿电镜过一遍是不现实的，人力物力和财力都撑不住。那么更经济实惠的方法，就是通过某些措施，让 病毒的组分 ，或是因为病毒而出现的 某些特殊物质 积攒到一定数量级后发光、变色，出现 宏观表现 。

那么我们的问题就转化成了，选择一种可以观察到宏观尺度变化的方法，和病毒的组分、病毒引发的某种物质产生关联。我们能选择的物质也摆在台面上：病毒的遗传物质，在这里是它的 RNA；病毒的包膜，也就是蛋白质外壳；以及，如果你还记得一些基础的生物知识，人体的免疫系统会在感染病毒之后产生抗体以抵抗入侵，它也是不错的选材。

我们目前采用的几种检测方式，也就从这些物质（以及它们的相关物质）脱胎而来，分别为针对遗传物质的核酸检测，针对包膜的抗原检测，以及针对抗体的血清抗体检测。

核酸检测

作为病毒的遗传物质，核酸序列载写了能够鉴定病毒为某一特定种的基因特征，因此核酸阳性，也就意味着病毒在体内存在过。

我们目前进行的「核酸检测」其实分为两个部分。平常我们进行的「捅鼻子」「捅嗓子」取样和后续的定性是第一部分。在取得标本之后，因为病毒量太少，样本会在实验室中进行一定次数的扩增，并根据荧光反应结果来判定阳性阴性。

第二部分，确定为阳性的样本，还需要通过基因测序，确定样本病毒的分型，以便溯源。这一步已经不属于日常筛查的范畴，但在流行病学调查上具有重大意义，如果有兴趣了解，可以参看 Wikipedia 简要了解。

我们平常参与的作为 筛查 工具的核酸检测，指的就是采集到定性的第一部分。

在感染了 SARS-CoV-2 之后，咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液等标本中均可发现病毒核酸。不同部分标本核酸检测的阳性率有一定差异，随着病程进展，各个部位的检出率也会发生变化。

我们习惯称呼的「鼻拭子」与「咽拭子」，其实都是采集咽腔后壁的分泌物与组织，前者采集鼻咽，后者采集口咽。也有采用其他标准的，比如唾液等亦可作为检测标本，本质上也是不同地区规定有差异

鼻（咽）拭子与（口）咽拭子已经是综合了阳性率与便利程度的考量。粪便和尿液等其实也可以作为标本采集的对象。而且根据一项对 31 例患者的研究，肛拭子的准确率要高于鼻咽与口咽采样，尤其病程后期，肛拭子确诊病例的鼻拭子阳性率不到 30%。 4 但显然，由于操作的限制，它无法作为早期筛查的首选手段。

接下来的工作，就是从获取的那一点点标本中提取核酸。由于样本中病毒的数量级很小，不足以拿来分析，还需要将其扩增并标记。需要用到的同样是高中学过的知识：聚合酶链式反应（PCR）——这一步看起来麻烦，但由于它的原理和工序已经研究成熟，实际操作中只需要加好试剂送机器，整个核酸检测的过程里最麻烦的还是让待测者安安分分弄来标本（笑）。

各地疾控机构或检测中心会采购合适的核酸 提取试剂盒 与核酸 检测试剂盒 。提取试剂盒负责将 RNA 从混杂的样本（细胞碎屑、分泌物、灰尘等杂质）中提取出来，常见的有磁珠法、离心柱法和释放剂法，不同提取方法可能对后期检测的准确度略有影响 。之后，提纯出的 RNA 就会移交给检测试剂盒（也有一些试剂盒将两者合一），进行之后的工序。

检测试剂盒带着样本在机器中进行的过程，就是这个检测中最主要的反应：RT-qPCR（实时定量逆转录聚合酶链反应）。

接下来需要你捡起高中生物的知识。一般的 PCR 反应有以下几步：

加热：让双链 DNA 解旋变形，成为两条单链； 退火：让混合的单链 DNA 与根据需要复制的片段而设计好的引物结合； 延伸：调整温度，让 DNA 聚合酶顺着引物开始工作，复制出新链，形成新的双链。

在对病毒的探测中，我们要做的工作也无非上面几步，只是需要多出两样东西：

在第一次反应之前，使用 逆转录酶 （依赖 RNA 的 DNA 聚合酶），合成病毒单链 RNA 的互补链，组合成 cDNA ； 在退火与延伸的阶段，除了引物和所需的酶外，还需要 TaqMan 探针 。

你可以把 TaqMan 探针这样理解：它的主体部分是一段寡核苷酸链，被设计成能和一小部分需要复制的基因片段配对成双链的样子；它一端接了一个荧光分子，另一端接了一个开关（淬灭基团），两者和探针相连时，荧光就会被淬灭基团压制，探测不到。退火时，这个探针会和引物一起结合在要复制的单链片段上。在延伸的过程中，DNA 聚合酶会把挡在面前的障碍物切碎，其中就包括这段探针，淬灭基团和荧光分子就这样分离，荧光就表现出来。

随着循环数的增多，扩增的 DNA 片段和荧光也越来越多。对比每个循环的荧光亮度和前若干次循环的基准亮度，我们就能得出目前的 DNA 片段量，也可以直接用循环数和荧光亮度做定性的判断。

那么具体复制哪一部分呢？既然要探测病毒，那我们就选取最有代表性的核酸片段。现行的标准中，ORF 基因与 N 基因是常用的检测位点。

检测试剂盒负责的就是将提取出的 RNA（样本）投入后，根据试剂盒上的程序说明，设定对应的 PCR 温度与时长，由机器控制完成扩增过程，在固定的环节收集荧光信号，记录对应的循环数（Ct 值）。判断阴性阳性 / 是否还具有传染力的标准，就是看荧光信号达到阈值时，目前循环数是多少。根据目前现行的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》，解除隔离管理的标准为 Ct 值 ≥ 35 。和此前通行的 ≥40 标准相比，出院与解除隔离的时间会大大缩短 。

免疫测定

经 RT-PCR 的核酸检测到现在都是确诊的金标准，因为它在方法学的角度看来，（理论上）可以做到 100% 准确。但核酸检测耗时长、对环境与操作人员要求高，在环境条件达不到标准、物资与仪器不齐全等情况下，大批量的核酸检测会带来巨大人力与财力消耗。

在本次疫情中，我们采用的免疫测定包括了快速抗原检测与抗体检测，它以 抗原-抗体反应 为基本原理，旨在通过抗原与抗体快速的中和效应，以较少的时间成本探测样本中是否存在待测物。两者都属于免疫层析法的范畴。

以盒装方式出现、可以自行操作的抗原检测就很适合作为物资不足、自我测定等情况下的补充。

抗原检测

核酸检测检查的是病毒的（标志性）遗传物质，是病毒的「内里」。那么（快速）抗原检测检查的就是病毒的「外在」，直接检查完整的病毒颗粒。目前通过审批的抗原检测试剂盒包括三种类型：胶体金法、乳胶法、荧光免疫层析法。三者内在原理一致。但其中荧光免疫层析法试剂盒仍然需要专用的检测仪或紫外线手电，不适合家庭自测；胶体金法和乳胶法则都是将检查结果转化成肉眼可见的条带，差别在于用于标记上色的物质不同。

当然，抗原检测自然有它的劣势在，它的 假阴性率 （是阳性但显示阴性）要更高，可能导致漏检错检。但放在一杯茶就能出结果的时间优势面前，准确性上的差距在某些特定情况下可以暂时让步。

图源：How the SARS-CoV-2 EUA Antigen Tests Work | ASM.org

和核酸检测相比，抗原检测增加了「鼻拭子」这一采样途径，降低了个人自测的难度。拭子上的样本在缓冲液中洗脱，取液体滴加在加样孔后，液体会因为毛细作用，带着潜在的抗原，经过一片预载了抗体的区域（结合垫，conjugate pad）。

这片区域上的抗体，是抗目标抗原（SARS-CoV-2）的单克隆抗体，每一个抗体分子都和特别的标记结合，它们与样本中的抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物，并随着毛细作用向下一条带流去。

紧接着经过的是检测线（T 线，test line），在检测线上附着的同样是抗目标抗原的单克隆抗体，你可以理解成这里的东西和结合垫上的一样，只是没带标记。此时，如果受测者已经感染了 SARS-CoV-2，他留在样本中的抗原形成的抗原-抗体复合物，会在此处与固定在线上的抗体再次结合。在这里，这些带着标记的复合物不断沉积，最终会显示出一条或深或浅的条带。条带的颜色来源，就是之前结合垫上的抗体分子附着的标记，在胶体金法中是胶体状态的金颗粒，在乳胶法中是上色的乳胶滴，在荧光法中是荧光分子。所以你在使用这类试纸时，会发现刚刚加样结束，液体刚开始扩散的时候，扩散的最前端会有一点点很淡的颜色不断推移，这就是还没有固定沉积的标记的颜色。

接下来，液体继续扩散，经过质控线（C 线，control line），在质控线上附着的是另一种抗体——『抗「抗目标抗原的单克隆 抗体 」 的 单克隆 抗体 』，简称「 二抗 」。这种新的抗体是让上一种抗体在另一种动物的免疫系统中反应得来的，比如结合垫的抗体来自兔，那这里的抗体就来自羊，是羊抗兔的单克隆抗体。也就是说， 二抗的抗原是 之前在 结合垫上的抗体 。这条线就是为了检测液体有没有正常扩散、结合垫上的抗体有没有失效等等而存在的。此时，液体中剩余的大量来自结合垫的抗体就会作为抗原，与质控线上的二抗发生抗原抗体反应，形成复合物，显出一条明显的条带。

由于结合垫上的抗体非常充裕，这条质控线条带会出现得非常快、非常显色，而检测线由于抗原（病毒）数量不一定，显色速度会有差别，但一般在 15 分钟内就足够判断结果。所以不要看 C 线很明显，T 线隐隐约约就觉得「没事了」， T 线不管深浅，只要有，就是阳性 。

具体操作方面，可以参考医政医管局发布的 教学视频。目前国家也在逐步推广抗原自测试剂盒，在一定程度上可以减轻未来医疗与街道的压力。

血清抗体检测

除了前两种检测手段外，还有一种使用不太多，但同样重要的检测方法，就是同属免疫测定方法的「血清抗体检测」。

抗体检测采用的试剂盒与抗原检测非常接近，但标本的限制更大——由于检测的对象变成了抗体，标本就必须是明确有抗体存在的血液（或血浆、血清）。而且人体在初次感染病毒后，并不会第一时间内产生抗体。抗体能够明确达到被检测的数量级，一般是在初次感染（或接种疫苗）的一到两周之后。这些条件限制了抗体检测不能作为确诊性质的检查。目前，血清抗体检测仅作为一定情况下检查疫苗是否生效，或查验受测者近期是否感染过新冠病毒的方法。

在人体中有五种抗体，分别是 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。IgA 主要负责黏膜免疫。IgD 与免疫反应激活有关。IgE 抵御寄生虫，同时也参与过敏反应。剩下的 IgG 与 IgM 就是对抗病原体的过程中，免疫系统派出的主力军。

SARS-CoV-2 作为病原体，人体经刺激主要分泌的就是 IgG 与 IgM 两种。现有的抗体检测试剂盒，主要也是针对人体对 SARS-CoV-2 的 N 蛋白（核衣壳蛋白）或 S 蛋白（刺突蛋白）产生的 IgG 与 IgM。

抗体试剂盒的检测装置外观和抗原检测别无二致。二者的差别就是上文中提到的结合垫、检测线、质控线上附着的物质。

这次，加样孔中滴入的样本可能有对 SARS-CoV-2 的抗体。因此，结合垫上就应当是带了标记物的抗原——当然不可能放活病毒上来。一般这里使用的都是设计检测的抗原蛋白，比如前文提到的 N 蛋白或 S 蛋白，或是重组病毒，无论是哪种，它都必须包含受体结合域（RBD）作为抗体结合的靶点。在检测线上，附着的就是抗 IgM 或抗 IgG 抗体，以捕获结合了抗原的抗体蛋白。最后，质控线上附着抗原的特异性抗体，捕获剩余的游离抗原。

小结

总的说来，三种检测方式针对的是不同的需求，互有优势，互相补充。核酸检测作为金标准，直接查验病毒的 RNA，负责看被检者带不带病毒；抗原检测作为快速检测方法，查的是病毒的蛋白质，但准确度不如核酸检测，对传染力强的感染者更有效；抗体检测查的是疫苗有没有生效、人近期有没有感染过病毒。

近期，新冠疫情在各地卷土重来。Omicron 变种与此前流行的 Delta 变种相比，虽然病死率与重症率明显下降，但潜伏期更短，病毒复制速度更快，传染力明显增强。希望大家在这样的环境中保持健康。

免疫印迹实验和酶联免疫的区别如下：

免疫印记一般是要把检测的样品转到膜上,再用抗体检测酶联免疫一般是把抗体固定在支持物上,再与要检测的样品反应,目标物就会与抗体结合而留在支持物上。

WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。

WB只能用抗体去检测你的蛋白样品。ELISA可以固定抗原也可以固定抗体。

WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；

免疫印迹实验：

免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。 免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot.

原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

酶联免疫实验：

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。

原理：

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：

①固相的抗原或抗体

②酶标记的抗原或抗体

③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

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