单细胞测序和单细胞核测序的区别

生物体正常的生理功能依赖于复杂的细胞及分子通过复杂的网络相互作用推进和完成，生物体的复杂程度在细胞类型、细胞比例、细胞的空间位置、细胞的基因表达、细胞间的通讯互作、染色质的状态、基因的序列等众多维度实现精准调控。单细胞测序作为新出现的强有力工具，正是解析细胞网络的合适技术手段，它通过一次性对数以万计的细胞进行检测，绘制出组织或器官的细胞图谱，明确细胞间的调控模式和状态变化，为解析生命机制提供细胞层次分辨率的系统见解。随着对科学研究的不断深入，单细胞测序（ScRNA-seq）的帝国包含了单细胞转录组测序，空间转录组测序、单细胞ATAC测序和单细胞免疫组等几个重量级产品，在不同水平揭示了组织内部的异质性。近期，有越来越多的研究者关注了单细胞核测序（SnRNA-seq）。相较于ScRNA-seq的针对单个细胞进行测序，SnRNA-seq制备单细胞核悬液，针对单个细胞核进行测序和分析。今天，我为大家详细比较以下两者的优劣势，看看两者更适用于怎样的研究场景。

影响ScRNA-seq结果的关键因素是单细胞悬液的质量，ScRNA-seq对细胞悬液的质量要求非常高（细胞数量、活性、浓度、背景干扰等），因此细胞悬液的制备只适用于新鲜组织或者冻存后复苏组织（主要是前者），这限制了ScRNA-seq的应用范围，意味着保存在超低温冰箱中、具有重要科研和临床价值的大量珍贵样本无法进行scRNA测序。

众所周知，解离过程中不同类型细胞在解离效率上存在差异，与免疫细胞相比，成纤维细胞和内皮细胞更多嵌于细胞外基质和基底膜中，因此更难以分解2；同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎，因此解离过程大概率无法有效的获取到组织中的所有细胞类型，导致结果的准确性大为降低。

部分样本类型，例如心脏、肌肉、脂肪组织含有直径较大的心肌细胞、骨骼肌细胞和成熟的脂肪细胞，这些细胞的共同点均是“大”，例如心脏中大的心肌细胞，长和宽分别能达到100μm/25μm，而目前商业化的单细胞平台对细胞大小均有限制，以10X Genomics平台为例，其芯片中微管道直径为50μm，建议捕获的细胞不要超过40μm，因此上机捕获前需要经过30-40μm细胞筛过滤去除大细胞。如果研究的样本类型为心脏、脂肪等且关注心肌细胞、脂肪细胞信息，ScRNA-seq就不再是一个合适的选择。

基于以上列出的ScRNA-seq的局限性，SnRNA-seq开始在一些研究中被广泛应用，以脑组织单细胞转录组研究为例，目前大多数文章更倾向于实用SnRNA-seq，包括神经细胞3-5、心脏6、7、肾脏8、9、肝脏10、11、脂肪12、13等。

已经有大量文献证明，SnRNA-seq能够解决ScRNA-seq中存在的主要问题，其优势主要体现如下：

由于核膜稳定性比细胞膜高，因此组织冻存后细胞核膜不会被破坏，因此 冻存组织可以提核做SnRNA-seq ，提高了单细胞测序的样本类型和实验设计丰富度。

因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。

直接冻存状态下对细胞进行机械破碎或者化学破碎，不会再出现酶解法引入的解离偏好性，相对而言细胞回收的全面性更高。通过比较分析了肾脏组织利用dropseq和10x两种平台的ScRNA-seq和SnRNA-seq的区别，发现SnRNA-seq的结果中包含了很多在scRNA中不存在的细胞类型，肾小球足细胞的比例增加了20倍14。

虽然SnRNA-seq相比较ScRNA-seq具有多方面的优势，但同样SnRNA-seq的劣势也比较明显：

SnRNA-seq只能检测细胞核中的mRNA, 缺失对细胞质中的mRNA分子的检测。同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用SnRNA-seq每个细胞核中检测到的基因会偏少，不利于细胞亚型的鉴定。

虽然上文提到SnRNA-seq可以提高细胞检测的全面性，但是其在某些细胞类型的再现上并没有优势。2020年发表在Nature Medicine的一篇文章15，对不同肿瘤类型的新鲜/冷冻样本进行ScRNA-seq和SnRNA-seq， 结果显示两种方法检测到的细胞类型相似，但比例差别较大：在神经母细胞瘤中， 相比SnRNA-seq，ScRNA-Seq中免疫细胞比例更高，神经嵴、神经内分泌细胞等实质细胞大幅减少；而SnRNA-Seq结果中实质性细胞（尤其是恶性细胞）比例更高，但是T细胞大幅减少，B细胞和NK细胞基本消失，内皮细胞、上皮细胞增加。

总体而言，若针对冻存样本、细胞直径大于40um以及相对较难解离的植物样本，建议采用SnRNA-seq；一些较难解离的动物样本，派森诺的单细胞研发团队可提供一对一个性化的解离方案，让科学研究多一种选择。某些具体情况，则要根据研究目的进行个性化地调整。例如，关注肝癌样本中的肝实质细胞，SnRNA-seq是更佳的方案；关注肝癌样本中的免疫细胞，ScRNA-seq是更加方案。若关注肝癌样本中的肝实质细胞和免疫细胞，则可联系您身边的派森诺销售，让派森诺的资深技术支持，提供个性化的实验方案。

参考文献：

https://www.cn-healthcare.com/articlewm/20210611/content-1230956.html

1、Defining cell types and states with single-cell genomics

2、Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations

3、A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain

4、Alzheimer's Patient Microglia Exhibit Enhanced Aging and Unique Transcriptional Activation

5、A Spatiomolecular Map of the Striatum

6、Cells of the adult human heart

7、Transcriptional heterogeneity of fibroblasts is a hallmark of the aging heart

8、A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys

9、Complementary Roles for Single-Nucleus and Single-Cell RNA Sequencing in Kidney Disease Research

10、Single-Nuclei RNA Sequencing Assessment of the Hepatic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin

11、Characterizing the Heterogeneity of Liver Cell Populations Under a NASH-Related Hepatotoxicant Using Single-Nuclei RNA Sequencing

12、Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution

13、SnRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis

14、Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis

15、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors

DNA和RNA的碱基有什么区别？

相同点：都携带基因，跟遗传有关。二者的区别如下：

1、分布不同：

即DNA主要在细胞核内，是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。RNA主要在细胞质中，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。

2、数量不同：

DNA 分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。

RNA只有一条核糖核苷酸链组成，由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。

3、核糖不同：

DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T。

百度百科-脱氧核糖核酸

百度百科-核糖核酸

基因是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。

DNA（脱氧核糖核酸）被广泛认为是存在于我们所有细胞的细胞核中含有遗传信息的分子。它的形状像一个双螺旋，因此称为核苷酸的小片段组成。

DNA分子有两个链条，线圈周围形成双螺旋携带遗传指令用于生长、发展、功能，和所有已知的生物和许多病毒的繁殖。DNA和核糖核酸是核酸；与蛋白质、脂质和复合碳水化合物（多糖）一样，核酸是所有已知生命形式所必需的四种主要大分子之一。

每个核苷酸包含一个磷酸基、一个糖基和一个氮基。这种特殊分子中的糖成分称为脱氧核糖，构成DNA中的D。这是一种环状碳基化学物质，由五个碳原子组成五边形。在第二个碳原子上，脱氧核糖中有一个附着的奇异氢原子。它还可以连着一个氧。在这种情况下，含氧的化学物质就会形成核糖——RNA中的R。

脱氧英文前缀的意思是没有氧

核糖核酸（RNA）是一种高分子分子，在编码、解码、调控和表达基因的各种生物学作用中发挥着重要作用。RNA和DNA是核酸，与脂类、蛋白质和碳水化合物一起构成所有已知生命形式所必需的四大大分子。和DNA一样，RNA是由核苷酸链组装而成的，但与DNA不同的是，在自然界中，RNA通常是单链折叠而成，而不是成对的双链。细胞生物利用信使RNA （mRNA）传递指导特定蛋白质合成的遗传信息（利用鸟嘌呤、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶的含氮碱基，用字母G、U、A和C表示）。许多病毒用RNA基因组编码它们的遗传信息。

一些RNA分子通过催化生物反应，控制基因表达，或对细胞信号的传感和通讯反应，在细胞内发挥着积极的作用。其中一个活跃的过程是蛋白质合成，这是一种普遍的功能，其中RNA分子直接在核糖体上组装蛋白质。这个过程利用转移RNA（tRNA）分子将氨基酸传递到核糖体，核糖体RNA （rRNA）将氨基酸连接在一起形成蛋白质。

RNA的化学结构与DNA非常相似，但主要有三个方面的不同：

1、与双链DNA不同，RNA是单链分子，在许多生物学作用中，它由更短的核苷酸链组成。然而，RNA可以通过互补碱基配对形成内链（即单链）双螺旋结构，如tRNA。

2、DNA的磷酸糖“主干”含有脱氧核糖，而RNA则含有核糖。核糖的戊糖环上有一个羟基在2'的位置，而脱氧核糖没有。核糖主干中的羟基使RNA比DNA更不稳定，因为它更容易水解。

3、DNA中腺嘌呤的互补基是胸腺嘧啶，而RNA中是尿嘧啶，它是胸腺嘧啶的一种未甲基化形式。

像DNA一样，大多数具有生物活性的RNA，包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA和其他非编码RNA，都含有自互补序列，允许部分RNA与自身折叠成对，形成双螺旋。对这些RNA的分析表明它们是高度结构化的。与DNA不同的是，它们的结构不是由长双螺旋组成，而是由一组短螺旋组成的类似蛋白质的结构。通过这种方式，RNA可以实现化学催化（比如酶， enzymes）。例如，核糖体（RNA-蛋白复合物，催化肽键的形成）结构的测定表明，其活性位点完全由RNA组成。

RNA和DNA的形状

核酸糖几乎能做脱氧核糖能做的所有事情，它还能编码某些细胞和生物体的遗传信息。当氧气存在时，它会极大地改变化学物质的结合方式，并与其他分子共存。在RNA中，当氧存在时它可以有多种形状。当氧不在DNA的这个特定位置时，这种分子就形成了标志性的双螺旋结构。

利用RNA

DNA通常被分解成RNA，并被细胞读取，以便翻译和转录遗传密码，以制造生命所必需的蛋白质和其他分子。RNA使用与DNA相同的三个碱基对：胞嘧啶，鸟嘌呤，腺嘌呤。另一碱基对胸腺嘧啶在RNA中被替换为尿嘧啶。RNA也常存在于较简单的生物体中，如细菌。它通常也是一种病毒，带有肝炎、流感和HIV所有形式的RNA。

线粒体RNA

所有的动物细胞都使用DNA，只有一个明显的例外：线粒体（mitochondria）。线粒体是细胞的能量来源，通过克雷布斯循环将葡萄糖转化为丙酮酸，然后转化为三磷酸腺苷（ATP）。这个过程都是在细胞中的一个细胞器中完成的，ATP是能量的普遍形式，在所有有氧生物中都使用。在线粒体中有一小段RNA，这在动物界是独一无二的。它完全由母亲遗传（父亲生活在精子中，但在受精过程中溶解），并允许人类追溯其母亲的血统。

线粒体是一种双膜结合的细胞器发现于大多数真核生物。然而，一些多细胞生物中的一些细胞可能缺少它们（例如，成熟的哺乳动物红细胞）。许多单细胞生物，如微孢子虫、副孢子虫和双胞体，也减少或将线粒体转化为其他结构。到目前为止，只有一种真核生物，即单角丝虫病，已经完全失去了线粒体。线粒体产生细胞供应的三磷酸腺苷（ATP）的大部分，作为一种化学能的来源。

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