EDTA与EDTA钠的区别是什么？做PCR-SSCP时配置电泳液时需要的是哪个？

在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用.

2)电泳

取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.

3)银染法

将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.

四、SSCP的应用

自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测 了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCP还用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名B 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比 较，发现在全长2.6kbp的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测 出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏 性.

SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研究中.Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品 进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不 仅证明了HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性，为保证PCR诊断 结果的可靠性找到了好方法.另外，Yap等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变p53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同 的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域 发挥着巨大的作用.

五、SSCP注意的事项

SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应注意下列事项.

①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变， SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的 立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的 结果.

②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链 的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用 较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bp的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以 上.

③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度 升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较 高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使 不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.

④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的 影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链 上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾 设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发 夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明 DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.

⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因 此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判 定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检 测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无 变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有 改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具 体实验进行选择确定.总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法， 适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着 SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具.

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