固有免疫系统的组成和特点各有哪些

固有免疫系统主要由组织屏障、固有免疫细胞和固有免疫分子组成.

1．组织屏障包括皮肤黏膜及其附属成分和体内屏障

(1)皮肤黏膜及其附属成分：包括由致密皮肤和黏膜组成的物理屏障,皮肤和黏膜分泌的杀菌物质、体液内溶菌酶和抗菌肽、胃酸等组成的化学屏障,寄居在皮肤和黏膜表面的正常菌群组成的微生物屏障.

(2)体内屏障：包括血一脑屏障和血一胎屏障.血一脑屏障组织结构致密,能阻挡血液中病原体等进入脑组织及脑室.血一胎屏障由母体子宫内膜的基蜕膜和胎儿的绒毛膜滋养层细胞共同构成,可防止母体内病原体进入胎儿.妊娠3个月内血一胎屏障发育未完善,孕妇感染风疹病毒和巨细胞病毒可导致胎儿畸形或流产.

2．固有免疫细胞主要包括吞噬细胞(中性粒细胞和单核吞噬细胞)、树突状细胞、NK、NK T、y占T、B1、肥大细胞、嗜碱粒细胞和嗜酸性粒细胞等.

(1)中性粒细胞：占血液白细胞总数的6 0％～70 9／6,具有很强趋化作用和吞噬功能.局部病原体感染时,它们可迅速穿越血管内皮细胞进入感染部位,发挥吞噬杀伤作用.也可通过表面表达的IgG Fc受体和补体C3b受体发挥调理吞噬、杀菌作用.

(2)单核一巨噬细胞：包括血液中的单核细胞(monocyte)和组织器官中的巨噬细胞(mac—rophage).早期单核细胞占血液中白细胞总数的3％～8％,胞质中富含溶酶体颗粒,单核细胞进人各组织后分化为皮肤langhas细胞、肝脏库普弗细胞、脑部小胶质细胞、骨组织的破骨细胞、肺泡巨噬细胞等.单核／巨噬细胞可做变形运动,有很强黏附能力.巨噬细胞胞质内富含溶酶体及线粒体,具有强大的吞噬、杀菌、清除凋亡细胞能力.巨噬细胞不仅是执行固有免疫的重要效应细胞,作为抗原递呈细胞以及分泌细胞因子也在适应性免疫应答中起重要辅助功能.巨噬细胞的吞噬杀菌机制包括：①氧依赖性途径：反应性氧中间物(ROI)和反应性氮中间物(RNI).②氧非依赖途径：酸性环境、溶菌酶、防御素(defensin).巨噬细胞参与炎症反应的机制：①分泌MIP一1 a／13、MCP一1和IL一8等趋化因子,募集、活化更多巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞,发挥抗感染作用；②分泌多种促炎症细胞因子(如II.一1、TN F—Q、IL一6)和炎性介质(前列腺素、白三烯、血小板活化因子等),促进炎症反应.

(3)树突状细胞(dendritic cell,DC)：具有许多分枝状突,占人外周血单个核细胞的1％,包括表皮朗格汉斯细胞(LC)、胸腺的并指树突状细胞(IDC)；外周免疫器官的滤泡树突状细胞(folli cular dendritic cell,FD(二).DC是专职抗原递呈细胞,其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原,从而启动适应性免疫应答.DC是唯一能诱导初始T细胞活化的抗原递呈细胞.局部未成熟DC接受抗原或炎性介质刺激后可分化为成熟DC,并迁移至引流淋巴结,执行抗原递呈功能和激活T细胞功能.未成熟DC高表达IgG Fc受体、C3 b受体、甘露糖受体,摄取、加工处理抗原能力强,低表达MHC工／Ⅱ类分子,递呈抗原激发免疫应答能力弱.成熟DC并高表达MHCⅡ／I类分子和共刺激分子(如B7和ICAM),其摄取、加工处理抗原能力弱,而递呈抗原、启动免疫应答能力强.

(4)自然杀伤细胞(natural killer,NK)：主要分布于外周血和脾脏,不表达特异性抗原识别受体,可非特异性直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞,故在机体抗肿瘤、早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫应答中起十分重要的作用.NK的杀伤机制与CTI.相似：穿孔素／颗粒酶途径和FasL／Fas途径.

(5)7,6T细胞：执行固有免疫功能的T细胞(y~TCR),分布于肠道、呼吸道及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织,在外周血中仅占CD3+T细胞的O．5％～1％.其’rCR缺乏多样性,识别：①感染细胞表达的热休克蛋白(HSP)；②感染细胞表面CDl分子递呈的脂类抗原；③分枝杆菌的某些磷酸糖.^y,艿T细胞是皮肤黏膜局部参与早期抗感染免疫的主要效应细胞,杀伤机制与CD8+CTL细胞基本相同.此外,活化的y占T细胞还可分泌IL一2、IL一4、’IFN一了、GM—CSF和TNF—Q等多种细胞因子,参与免疫调节.(6)B一1细胞：分布于胸腔、腹腔和肠壁固有层中,具有自我更新能力的CD5+、mIgM+B细胞.BCR缺乏多样性,识别①某些细菌表面共有的多糖抗原,如细菌脂多糖、肺炎球菌荚膜多糖和葡聚糖等；②某些变性的自身抗原,如变性Ig和变性单股DNA.B一1细胞产生抗体特点：①4 8小时内即可产生以IgM为主的低亲和力抗体,对机体早期抗感染免疫和清除变性自身抗原具有重要作用；②不发生Ig类别转换；③无免疫记忆.B一1细胞在机体早期抗感染免疫和维持自稳中具有重要作用.

未成熟DC和肿瘤细胞共培养后，怎样测DC表面标志培养原理1．DC培养用细胞因子：nGM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHCII类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。nIL-4(白细胞介素-4)IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immatureDC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHCI类、II类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)，但不表达CD14。nTNF-a(肿瘤坏死因子-a)TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHCII类分子区室(classIIcompartment)消失，但能够上调细胞表面MHCI类、II类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(matureDC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。2．CIK培养用细胞因子和抗体：nCD3激发型单抗：T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(Tcellantigenreceptor,TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck,Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。nIL-2(白细胞介素-2)IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor,TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。nIFN-g(干扰素-g)IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。nIL-1a(白细胞介素-1a)IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK的细胞毒作用。细胞制备1．外周血单个核细胞的采集1.1用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100ml；1.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。1.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3x108。2．(可选步骤)肿瘤抗原的制备用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-SpecificAntigens,TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-AssociatedAntigens,TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：2.1手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；2.2无菌生理盐水洗3次；2.3用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI1640培养基，充分研磨；2.4200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；2.5用RPMI1640培养基重悬细胞至1-2x107/ml，装入5ml无菌冻存管中；2.6将冻存管浸入液氮中速冻，10min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10min。反复3-5次；注：也可以-80℃/37℃反复冻融3-5次。2.7将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；2.8收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；2.9-80oC保存备用。3．CIK细胞的培养及鉴定3.1步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2x106/ml，置于培养瓶内；3.237℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;3.3收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2x106/ml；3.4加入1000U/ml的重组人IFN-g培养；3.524h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；注：此时也可同时加入100U/ml的重组人IL-1a。3.6每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2300U/ml；3.7在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x109个以上。3.8CIK细胞质控：3.8.1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；3.8.2用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。4．DC细胞的培养及鉴定4.1步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF500-1000U/ml和重组人IL-4500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；4.2每3d半量换液一次，并补足细胞因子；4.3(可选步骤)在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50mg/ml，对DC进行抗原负载；注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。4.4在培养的第6d，加入重组人TNF-a(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；4.5在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上；4.6DC的质检：4.6.1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；4.6.2流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC是否成熟。5.DC-CIK细胞的制备和质检5.1收集步骤4和步骤3中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1∶10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；5.2每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2(300U/ml)。5.3在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；5.4DC-CIK细胞的质检：5.4.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；5.4.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。5.4.3细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。5.4.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素

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