细胞培养步骤

细胞培养是在实验室中通过人工方法培育和繁殖细胞的过程，细胞培养的一般步骤包括：细胞株选择和准备、培养基配制和消毒、细胞接种、培养条件控制、细胞培养和维护、细胞检测和鉴定。

1、细胞株选择和准备：选择适合研究目的的细胞株，并从存储的冻存细胞样品中取出。将细胞解冻并迅速传输到培养皿中。

2、培养基配制和消毒：准备适当的培养基，包括营养物质和生长因子。按照配方准确称量和混合所需的培养基成分，并进行高温高压消毒，以确保无菌条件。

3、细胞接种：将培养基加入含有细胞的培养皿中，使细胞悬浮在培养基中。可以使用细胞传代或原代培养方法，根据需要调整初始细胞密度。

4、培养条件控制：确定适当的培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度和氧气浓度。将细胞放置在恒温培养箱或细胞培养箱中，并控制好以上条件。

5、细胞培养和维护：定期观察细胞的生长情况，根据需要添加新的培养基。细胞培养过程中可能需要进行细胞分裂、转移、传代或冻存等操作。

6、细胞检测和鉴定：通过形态学观察、细胞计数、细胞增殖曲线等方法，检测和鉴定细胞的纯度、活力和健康状态。

请注意，具体的细胞培养步骤可能会因不同的细胞类型、研究目的和实验室的特定要求而有所变化。在进行细胞培养实验时，应遵守相关的实验室操作规范和安全指南，确保实验的安全性和准确性。

细胞培养在生物学和医学研究中有着广泛的应用

1、细胞生物学研究：通过细胞培养可以获取大量的细胞，并在受控条件下进行实验。这使得科研人员能够深入研究细胞的生理、生化和遗传特性，探索细胞的结构与功能之间的关系，以及细胞如何对外界刺激做出反应。

2、药物筛选和药效评估：细胞培养可以用于药物的初步筛选和评估。在细胞培养中，科研人员可以测试不同药物对细胞的影响，评估它们的治疗效果、毒性和副作用等。这有助于加速新药开发过程，为临床治疗提供候选药物。

3、疾病模型研究：通过培养患者来源的细胞，可以建立各种疾病的细胞模型。这些模型可以用于研究疾病的发病机制、筛选治疗方法，以及评估新药对疾病模型的疗效。细胞培养为深入理解疾病的发生和治疗提供了有力工具。

4、组织工程和再生医学：细胞培养为组织工程和再生医学提供了基础。科研人员可以通过培养和扩增细胞，再将其应用于组织重建、移植和修复。例如，通过细胞培养可以获得干细胞，进而分化成不同类型的细胞，如心肌细胞、神经细胞等，用于治疗心脏病、神经退行性疾病等。

5、病毒研究和疫苗生产：细胞培养在病毒学和疫苗生产中起到关键作用。研究人员可以通过培养感染细胞来研究病毒的生命周期、传播途径和免疫机制，并开发相应的疫苗和抗病毒药物。

总之，细胞培养在生物医学领域起着重要作用，通过控制细胞的生长环境和条件，使得研究人员能够深入研究细胞的结构和功能，为药物研发、疾病治疗和组织工程等方面提供重要支持

细胞活力测定常用的简便方法是

1.转瓶培养

这个比较老的工艺，在逐步淘汰，不过投资少，技术含量低，人员经少量培训就可以操作。

2.悬浮培养

非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。

细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以子。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。

通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。

利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。

一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～120 r/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。

在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

实验材料

细胞悬液

试剂/试剂盒

台盼兰 四甲基偶氮唑盐 酸化异丙醇

仪器/耗材

普通显微镜 血球计数板 试管 吸管 酶标仪 分光光度计

实验步骤

一、细胞计数

1. ?将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2. ?将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3. ?静置3分钟。

4. ?镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10 000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

二、细胞活力

1. ?将细胞悬液以0.5 ml加入试管中。

2. ?加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟。

3. ?吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4. ?镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

三、MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

1. ?细胞悬液以1 000 rpm离心10分钟，弃上清液。

2. ?沉淀加入0.5-1 ml MTT，吹打成悬液。

3. ?37℃下保温2小时。

4. ?加入4-5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。

5. ?1 000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570 nm比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

收起

注意事项

1.镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

2.死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

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